牛奶营养成分丰富，是人们日常生活中重要的营养来源之一。为消灭牛奶中对人体有害的微生物和酶，工业生产中会对牛奶进行热处理,而牛奶中的乳清蛋白经热处理后极易发生变性，使其活性蛋白丧失活性。巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌(UHT)仍是国内外目前乳制品热处理的主要方式,随着现代食品工业的不断发展，蒸汽侵入式直接杀菌(INF)技术成为目前国际上一种先进的牛奶杀菌方式，该技术将牛乳在159℃、0.09 s条件下瞬时加热，采用此技术制备牛奶，对蛋白质等营养物质的破坏度小，营养成分保留更高，口感更新鲜。美拉德反应是液态乳杀菌过程中的重要反应之一，其产物会对乳品质量产生较大影响。美拉德反应的两个产物糠氨酸和羟甲基糠醛(HMF),分别是作为反应指示物的初始产物，以及作为反应进行程度评价指标的中间产物。乳果糖可鉴别不同热处理牛乳，目前国际上通常用糠氨酸和乳果糖作为评估热处理对奶制品质量影响的指标。本研究通过对INF杀菌乳及其他3种常见热处理灭菌乳的研究，分析不同热处理方式对牛奶乳清蛋白的影响，包括活性蛋白组成、含量及微观结构的改变，从而提高消费者对热处理灭菌乳的认识，改变消费理念，这也与我国目前提倡的“国家优质乳工程”相契合。

LC-20AD型高效液相色谱仪；pH计(精度0.1);离心机(转速≥10 000 r/min);ME204分析天平;1600PC紫外-可见分光光度计；S-3400N扫描电子显微镜(SEM),HITACHI;IR Prestige-21傅里叶变换红外光谱仪，SHIMADZU;日立F-2700荧光光谱分析仪；Zetasizer Nano S90纳米粒度测定仪，Malvern; FW-4A 粉末压片机；DHG-9140A电热鼓风干燥箱。

磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甘氨酸、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙酸铵、辛醇、过氧化氢(质量分数为30%)、硫酸锌、亚铁氰化钾、硫酸铵、硫酸镁(均为分析纯);冰醋酸(优级纯，室温保存)、三氟乙酸(色谱纯，99.9%,4℃保存)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、肝素亲和柱(4℃冰箱内储存)。

奶场牛乳：当天采集，不进行任何热处理；巴氏杀菌乳：取奶场牛乳于65℃的水浴锅中加热30 min; INF杀菌乳：取奶场牛乳在157℃的条件下加热0.09 s; UHT灭菌乳：取奶场牛乳于137℃下加热处理4 s。

将1.3中的4种热处理牛奶样品进行离心脱脂，离心条件为4℃、10 000 r/min离心10 min, 弃去上层脂肪后得到脱脂乳。利用酸等电点沉淀离心法制备乳清蛋白：用1 mol/L HCL将脱脂乳的pH调至4.6,于4℃、5 000 r/min离心20 min,取上清液密封置于-20℃冰箱内待测。

精确称取各样品20 g(精确到0.001 g)置于50 mL容量瓶中，加入适量pH为6.5的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(流动相A),超声提取20 min, 冷却至室温后用pH为2.5的甘氨酸盐酸缓冲液(流动相B)定容，摇匀后将样品移至离心管4℃ 10 000 r/min离心10 min。取过滤液2.5 mL,通过Pharmacia HI-Trap Protein G柱净化后定容至1.5 mL,液相色谱分析。采用色谱柱CAPCELL PAK C18(4.6m mL.D.×250 mm, 5 μm)等度洗脱，流动相为乙腈：0.1%三氟乙酸=6:4,流速为1 mL/min, 进样体积为20 μL,在紫外280 nm下进行检测。

参考河北省奶业协会发布的《活性蛋白牛乳(牛)》中的方法对4种牛奶中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行测定。取1.4中制备的4种乳清蛋白各1 mL稀释10倍后，过0.22 μm滤膜，上机待测。采用色谱柱：BEH300 C4(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300 Å),进行梯度洗脱分离。流动相A为含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流动相B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速为0.3 mL/min, 进样体积为10 μL,在紫外280 nm下检测。

(1)配制由84 mmol/L Na2HPO4和16 mmol/L NaH2PO4制成的结合缓冲液。(2)精确称取5 g牛奶样品于100 mL三角瓶中，加入30 mL结合缓冲液涡旋振荡1 min后移至50 mL容量瓶，加入结合缓冲液定容；(3)将样本移至离心管，离心条件为4℃、12 000 r/min、10 min, 使用移液器轻轻吸出10～30 mL中间液作为样品提取液；(4)配制由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaCl制成的淋洗液以及由42 mmol/L NaH2PO4、8 mmol/L NaH2PO4、1 mol/L NaCl制成的洗脱液；(5)加5 mL结合缓冲溶液于肝素亲和柱内进行平衡，加样品提取液，待其完全流出后，加入10 mL淋洗液，并弃去全部流出液，再加入2.5 mL洗脱液，收集全部流出液，并定容至3.5 mL,过滤膜供液相色谱检测用。(6)采用色谱柱：BEH300 C4(Waters, 100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 300 Å)进行梯度洗脱。流动相A为含有0.1%三氟乙酸的水溶液、流动相B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈，流速为0.45 mL/min, 进样体积为10 μL,在紫外280 nm下检测。

参考NY/T 939—2016《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》测定糠氨酸含量。吸取1.3中4种不同热处理的牛奶各2 mL和10.6 mol/L盐酸溶液6 mL一同加入密闭耐热试管中，混匀后将试管置于干燥箱，110℃下加热水解12 h以上，加热结束后，冷却过滤，滤液为水解液。吸取1 mL水解液于试管中，加入6 g/L乙酸铵溶液5 mL,混匀后过0.22 μm水相滤膜，滤液上机测定。采用色谱柱：C18硅胶色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)梯度洗脱、流动相A为0.1%三氟乙酸溶液、流动相B为甲醇，流速为1 mL/min, 进样体积为10 μL,在紫外280 nm下检测。

采用Ellman’s 5,5’-双硫代双(2-硝基苯甲酸，DTNB)法测定不同热处理后乳清蛋白溶液的表面巯基含量。称取适量样品，溶于蒸馏水配制成质量浓度为2 mg/mL的溶液，吸取1 mL蛋白溶液，加入4.0 mL Tris-甘氨酸缓冲液I和50 μL Ellman’s试剂，混合均匀后于37℃恒温培养15 min; 并于412 nm波长下测定吸光度。

参考NY/T 939—2016《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》测定乳果糖含量。

室温下采用Malvern纳米粒度测定仪进行粒径分布的测定。将4种乳清蛋白样品用去离子水稀释5倍，调整颗粒折射率为1.59,分散剂折射率为1.33,分散剂吸收率为0.887 2。

将4种乳清蛋白溶液用去离子水稀释适当的倍数，设置激发波长为290 nm, 在此波长下进行发射波长的扫描，扫描光谱范围为300～450 nm, 扫描速度为60 nm/min, 激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

取1.4中4种热处理牛奶乳清蛋白各5 mL样品平铺于培养皿中，冷冻干燥48 h制成冻干粉。用称量勺挑取少量冻干粉样品置于粘有双面胶的样品台上，用洗耳球吹去附着的和未固定牢的样品，喷金120 s后用扫描电镜观察。

采用傅里叶变换红外光谱仪测定蛋白质的二级结构。准确称取1.5 mg 1.8.3中的冻干粉样品置于玛瑙研钵中，再称取150 mg干燥的溴化钾(样品：溴化钾=1:100),研磨均匀后用压片机制成供试片备用。测定时将供试片置于红外光谱仪的样品光路中，设置分辨率为4 cm-1,在波数范围为4 000～400 cm-1进行扫描，扫描次数为32次，利用Origin 2021对红外光谱进行分峰拟合计算。

如图1可知，奶场样品中乳清活性蛋白总量在4种不同热处理样品中最高，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均为最高，分别为1 413.3 、4 024.4 mg/L。UHT灭菌乳中乳清活性蛋白总量最低，其中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白含量均为最低，分别为116.2、378.9 mg/L,且乳铁蛋白和免疫球蛋白基本没有检出。INF杀菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量与巴氏杀菌乳相当，但免疫球蛋白含量低于巴氏杀菌乳。从4种不同热处理牛奶中乳清活性蛋白的含量可以看出，随着热处理温度的升高和时间的增加，乳清蛋白中活性蛋白含量呈现下降趋势。

由表1可知，奶场样品中乳果糖和糠氨酸含量均为最低，分别为7.25 、3.65 mg/100 g; 巴氏杀菌乳和INF杀菌乳中两者含量基本相当；UHT灭菌乳中两者含量均为最高，分别为13.97 、166.3 mg/100 g, 其中糠氨酸含量是其他热处理牛奶的10倍以上。Leen Mortier等对比利时市场上的各种奶类共154个奶样进行检测，结果发现，UHT灭菌乳中的平均乳果糖和糠氨酸含量是巴氏杀菌乳中的10倍以上，具有显著性差异，这也与本实验的结果一致。由图2可知，UHT灭菌乳中表面巯基含量最高，为52.7 μmol/L,奶场样品中含量最低，为17.5 μmol/L,巴氏杀菌乳和INF杀菌乳中表面巯基含量相当，分别为27.8 、32.9 μmol/L。牛乳中约90%的巯基位于β-乳球蛋白上，每个β-乳球蛋白单体均含有1个游离巯基及2个二硫键，β-乳球蛋白随着热处理温度的升高以及加热时间的增加，发生热变性，从而使其分子链展开，将其巯基暴露出来，故表面巯基的含量逐渐增加。

由图3可知，4种不同热处理的牛奶样品中，UHT灭菌乳的乳清蛋白平均粒径最大，其次是INF杀菌乳，巴氏杀菌乳和奶场样品的乳清蛋白平均粒径大小相当。粒径是影响牛奶稳定性的重要因素之一，不同热处理方式牛奶中的乳清蛋白会发生不同程度的变性，导致蛋白的平均粒径发生变化，这可能是因为乳清蛋白分子之间生成凝聚物。

由表2可知，本试验中4种不同热处理牛奶的乳清蛋白最大荧光强度均>330 nm, 由Halder U C等的研究可知，最大荧光强度值反映色氨酸残基的微环境，当色氨酸残基处于蛋白质分子外部的极性环境中时，最大荧光强度值>330 nm, 故本实验4种热处理牛奶的乳清蛋白均处于极性环境中。与奶场样品相比，巴氏杀菌乳和INF杀菌乳的最大荧光强度值无明显变化，而UHT灭菌乳的乳清蛋白最大荧光强度大于其他3种热处理奶样，可能是因为UHT灭菌乳经高温较长时间热处理后，导致维持蛋白质构象的疏水相互作用被破坏，蛋白的极性环境增加。3种热处理牛奶相较奶场样品其乳清蛋白荧光强度均有降低，虽然INF杀菌乳热处理温度最高，但其加热时间不足1 s, 明显小于UHT灭菌乳的加热时间，故UHT灭菌乳蛋白质结构破坏严重，其荧光强度降低最为显著。

图4为4种不同热处理牛奶乳清蛋白的扫描电镜图，其中图A为未经热处理的奶场样品，可以看出其蛋白质结构大小比较均匀，表面比较光滑。与图A相比，图B到图D开始呈现更不规则且无序的结构，其中UHT杀菌乳的乳清蛋白结构明显增大且有片层出现，这可能是因为高温较长时间的加热可以破坏蛋白质非共价力，导致多层聚集体和大聚集体的形成。对大豆蛋白进行干热处理，扫描电镜结果也显示样品呈现出多层片状的破碎结构。

参考相关文献可知，蛋白质二级结构中，1 645～1 658 cm-1为α-螺旋结构，1 665～1 680 cm-1为β-折叠结构，β-转角结构在1 640～1 644 cm-1和1 681～1 690 cm-1,无规则卷曲结构在1 659～1 664 cm-1。采用Omnic 8.2软件得到4种不同热处理牛乳乳清蛋白的红外光谱分析图，再用PeakFit 4.2计算各二级结构含量。由图5可知，随着热处理温度的升高，1 600～1 700 cm-1间子峰的强度发生改变，说明4种不同热处理牛奶的乳清蛋白二级结构发生了变化。结合表3可得，奶场样品的α-螺旋结构最多，为39.06%,经过UHT灭菌后，其含量降低至13.81%,随着温度和热处理时间的增加，α-螺旋有着明显降低的趋势。巴氏杀菌乳和INF杀菌乳的二级结构组成基本相当。从表3还可以看到，无规则卷曲在奶场样品中最低为7.02%,在UHT灭菌乳中组成最高，为29.61%。蛋白质分子外部环境变化导致蛋白质二级结构的改变，使其发生构象改变和折叠。α-螺旋是最常见也是最稳定的蛋白质二级结构，随着热处理温度的升高，α-螺旋的逐渐减少可能是由于蛋白热变性导致α-螺旋氢键断裂，发生解螺旋。无规则卷曲的增多表明，乳清蛋白结构的随机性随热处理增强，使有序结构逐渐向无序结构转化。

本试验通过对4种不同热处理牛奶的乳清蛋白含量、微观结构及美拉德反应产物含量等方面进行研究，结果发现：(1)奶场牛奶乳清活性蛋白总量最高，UHT灭菌乳含量最低。INF杀菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量与巴氏杀菌乳相当。(2)UHT灭菌乳中糠氨酸和乳清蛋白溶液表面巯基含量均明显高于其他3种热处理奶样，乳果糖含量略高于其他3种奶样。INF杀菌乳中乳果糖、糠氨酸及表面巯基含量均与巴氏杀菌乳相当。(3)4种热处理牛奶中，巴氏杀菌乳、INF杀菌乳及UHT灭菌乳的粒径大小较奶场样品有不同程度的增加，其中UHT灭菌乳的增加最为显著；UHT灭菌乳中乳清蛋白极性环境的增加大于其他3种热处理牛奶。(4)随着热处理时间和温度的增加，4种牛奶乳清蛋白二级结构中α-螺旋逐渐减少，无规则卷曲逐渐增加，乳清蛋白结构从有序向无序转化。INF杀菌乳和巴氏杀菌乳的变性趋势基本一致，优于UHT灭菌乳。