0 引言

大肠杆菌，学名大肠埃希氏菌，是人和动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。若此菌在水和食品中检出，可能是由于粪便污染，表示其中可能有肠道病原菌，因此，对大肠杆菌的检测常作为重要卫生学标准之一。此外，部分致病性大肠杆菌侵入人体后可引起感染，有关食品中存在大肠杆菌导致人员中毒的现象屡见不鲜，如2013年在云南曾暴发因冷冻肉感染大肠杆菌而导致人员中毒事件2016年食堂工作人员携带非典型致病性大肠杆菌所造成食品污染导致26名小学生食源性疾病暴发事件。国外也同样出现了大肠杆菌危害食品安全的现象。1982—2002年美国曾有多例食源性大肠杆菌污染事件发生，其中有7例与乳制品相关。乳制品中大肠菌群的污染占有很大比例，在2016—2018年和2019年前三季度我国乳制品微生物项目监督抽检中，大肠菌群超标最为严重，其中发酵乳占有很大的比例。大肠杆菌具有一定的耐酸性，酸奶及乳饮料被其污染可能会影响产品质量，危害人类食品安全，监测大肠杆菌在产品中的检出及变化情况至关重要。

因此，本文模拟生产中产品污染大肠杆菌的情况，向酸奶及乳饮料中接种大肠杆菌，监控其在不同pH、储藏温度条件下，储藏过程中菌含量变化及pH的变化情况，为实际生产加工过程中产品冷藏及脱冷条件下大肠杆菌的检验检测和产品质量控制提供理论依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株为大肠埃希氏菌ATCC 25922。

1.1.2 试剂

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、营养肉汤培养基；氯化钠。

1.1.3 仪器与设备

BSC1500IIA2-X生物安全柜；FE28-TRIS pH计；HVM1涡旋仪；JJ1000A电子天平；BSP-250生化培养箱；MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

取保存于-80℃冰箱中磁珠管中的大肠杆菌标准菌株，取1粒磁珠转接至营养肉汤中，37℃培养24 h，活化三代后备用。

1.2.2 样品制备

(1）样品中不同浓度大肠杆菌在不同储藏温度下含量的变化

选取酸奶（250 g/瓶），乳饮料（300 mL/瓶）各16瓶，先将活化后菌液（1.2.1）用无菌生理盐水梯度稀释至103 CFU/mL和105 CFU/mL两个梯度，再将稀释后菌液接种至酸奶、乳饮料中使其菌含量约为10 CFU/mL和103 CFU/mL。以上接种后样品分别储藏于4℃和25℃两个温度条件下，定期测定样品中大肠杆菌含量变化。

(2）接种大肠杆菌验证在不同储藏条件下含量变化

市售酸奶pH范围一般为4.2～4.5，乳饮料为3.0～4.0，本试验酸奶的初始pH为4.2，乳饮料为3.6，因此，分别调节酸奶及乳饮料的pH为4.2和3.6两个组，然后无菌操作向样品中接种大肠杆菌至样品中菌含量约为103 CFU/mL，分别储藏于4℃和25℃条件下，测定样品中大肠杆菌含量变化及样品pH的变化情况。根据不同的储藏条件及pH分为以下四个组。

表1 样品的pH及储藏温度  

(3）不同pH营养肉汤对大肠杆菌含量的影响

在通常情况下营养肉汤培养基溶解后pH为7.5，本次试验调节初始营养肉汤培养基的pH分别为3.2,3.4,3.6,3.8,4.0,4.2,4.4,4.6,4.8，取1 mL大肠杆菌菌液分别接种到100 mL的营养肉汤管中，置于（36±1）℃培养箱中培养，定期测定大肠杆菌含量。

1.2.3 大肠杆菌含量测定

本试验采用《GB 4789.3—2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中第二法测定样品中大肠杆菌含量。

1.2.4 pH测定

采用校准后的pH计测定储藏过程中酸奶及乳饮料及营养肉汤培养基的pH。

2 结果与分析

2.1 酸奶及乳饮料中不同浓度大肠杆菌储藏后变化情况

通过向酸奶及乳饮料中接种低（10 CFU/mL，高（103 CFU/mL）两个梯度的大肠杆菌，模拟实际生产中产品低温储藏（4℃）及可能遇到的常温脱冷（25℃）的情况，探究酸奶及乳饮料中大肠杆菌随时间延长的含量变化情况。结果如表2所示，乳饮料在不同初始接菌量和不同储藏温度条件下，储藏16天后菌含量均降低至无法检出。酸奶样品储藏在4℃仍还有大肠杆菌存活，且高梯度中剩余量高达268 CFU/mL，但在25℃条件下储藏，无论是接种高梯度还是低梯度的大肠杆菌，样品中大肠杆菌含量均降低至无法检出（表2）。

造成以上差异的原因可能是由于温度适宜，乳酸菌产生抗菌物质，或者乳酸菌发酵产酸导致样品pH降低。从表中结果表明，大肠杆菌降低至无法检出的样品均为低pH的样品。因此，低pH可能对大肠杆菌的活性造成较大的影响。

2.2 不同pH对酸奶中大肠杆菌的影响

基于2.1的结果，即酸奶和乳饮料在储藏过程中大肠杆菌的存活情况不同的现象，进一步对其原因进行探究。经测定，酸奶初始pH为4.2。由图1a中可以看出，随着储藏时间的增加，pH4.2的酸奶样品在25℃条件下储藏pH不断降低，而在4℃条件下储藏pH基本保持不变。pH为3.6酸奶样品不管是在4℃和25℃储藏pH基本保持不变。

图1b显示出，储藏过程中，A条件下的酸奶中大肠杆菌整体呈现相对缓慢降低趋势，B,C,D条件下含量呈现减少趋势，降低速率较快。低pH酸奶（B,D）样品中菌均在储藏4天后降低至无法检出，C条件下储藏6天后降低至无法检出。相同储藏温度条件下，pH低的酸奶中大肠杆菌含量减少的更快，表明pH对大肠杆菌的活性造成了较大的影响。当酸奶pH为4.2时，冷藏（4℃）条件下，大肠杆菌及乳酸菌活性均受到抑制，乳酸菌在储藏过程中未进行明显的发酵产酸，酸奶在整个储藏过程中pH基本不变，因此大肠杆菌降低速率缓慢，储藏15天后仍有菌检出，为57 CFU/g，超出发酵乳三级采样最高安全限量值5 CFU/g，而在25℃储藏的酸奶中乳酸菌在相对适宜条件下，繁殖发酵产酸，导致储藏过程中酸奶pH明显降低至3.8，这可能对大肠杆菌产生了较大的影响，其降低速率明显高于低温储藏的酸奶样品，但在这其中乳酸菌也可能造成了一定的影响。当酸奶pH为3.6时，不同储藏温度间降低速率相差不大，由此可见，pH对酸奶中大肠杆菌的影响更为明显。

图1 酸奶在储藏过程中的大肠杆菌菌含量（a）及pH(b）的变化情况   

表2 不同产品在不同储藏温度条件下大肠杆菌含量及pH的变化情况  

2.3 不同p H对乳饮料中大肠杆菌的影响

乳饮料初始pH为3.6,A条件下储藏的乳饮料pH基本不变，而25℃储藏过程中pH降低，可降到3.4。与酸奶不同的是在pH 3.6的低pH下，25℃储藏乳饮料的pH持续降低，这可能是由于酸奶与乳饮料中乳酸菌菌种不同造成的。乳饮料中为更耐酸性的菌种，乳酸菌继续发酵产酸导致pH持续降低。（图2b）与酸奶相同，A条件下的乳饮料中大肠杆菌含量先略有增加后降低，可能是由于大肠杆菌对低温具有一定的抗性，随时间延长，不利于其生长，菌含量明显降低，其他条件下乳饮料中的大肠杆菌含量随着储藏时间延长而减少，B、C、D条件下的乳饮料分别在储藏10,6,4天后，大肠杆菌的量降低至无法检出，且样品pH分别为3.6,3.7,3.5，而A条件下的乳饮料直至储藏15天后仍有菌存活，为28 CFU/mL。图2a中可以看出，储藏温度越高，pH低的乳饮料中菌含量降低的越快。储藏温度及pH均对大肠杆菌的活性造成了一定的影响。

2.4 pH对大肠杆菌生长的影响验证

大肠杆菌对酸性具有一定的抗性，但相对更低的pH也会对大肠杆菌的活性造成影响。有文献报道大肠杆菌最低培养温度为7℃左右，适合生长的最低pH为4左右。表中为pH不同的培养基中大肠杆菌在培养过程中的变化情况。

当pH>3.8时，随着培养时间的延长大肠杆菌生长繁殖，菌含量增加，而当pH≤3.8时，随着培养时间的延长大肠杆菌活性受到抑制，菌含量逐渐降低，由此可见较低的pH对大肠杆菌造成了一定的影响。乳饮料的pH相对酸奶更低，因此，对大肠杆菌活性造成了抑制，加速了大肠杆菌的失活，低温条件下，正常乳饮料（pH 3.6）在储藏6天后菌含量降低为2 CFU/mL，随时间延长，第10天降低至无法检出，而酸奶（pH 4.2）在储藏15天仍有菌检出（图1a，图2a）。

3 结果与讨论

产品中大肠菌群污染控制对于消费者的食品安全来说至关重要，因此了解大肠杆菌污染产品后随着储藏时间及条件改变的变化规律具有重大意义。为了保障酸奶及乳饮料的品质，一般低温冷藏（4℃）保存，但当在出厂运输等过程中可能会出现脱冷的情况，因此研究保质期内产品中感染大肠杆菌后的变化情况具有重要意义。低pH明显加速大肠杆菌的衰亡，储藏温度及pH均对产品造成了一定的影响，但储藏温度对产品中大肠杆菌的影响可能是由于温度升高产品中乳酸菌发酵，pH降低导致的。当产品在运输、销售等过程中发生脱冷时，通常认为大肠杆菌可能繁殖，发酵产酸产气导致产品胀包，然而本试验过程中，产品中大肠杆菌并未增加，25℃储藏的酸奶及乳饮料在整个储藏期间均未发生胀包现象，相反pH降低加速大肠杆菌的灭亡。大肠杆菌在不同pH培养基中的生长状态，再次证明了pH对大肠杆菌的影响。这对于生产中实际检验检测具有一定的指导意义。大肠菌群作为生产过程卫生指示菌，对其的控制非常重要。由于pH对大肠菌群的影响，检测成品可能并不能代表真实情况，需要及时进行检验检测。因此，为了更好控制食品安全，对于酸奶类产品建议在发酵前或者成品灌装后及时检测。

图2 乳饮料在储藏过程中的菌含量（a）及pH(b）的变化情况   

表3 pH不同培养基中大肠杆菌随培养时间延长的变化情况